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偷拍图片 Nature Methods | CaST技巧鼎新: 非侵入性标志细胞步履的里程碑

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细胞内钙离子（Ca2+）信号在生物学中大批存在，是细胞信号传导的关节元素。现存的荧光传感器和证明基因天然不错检测到Ca2+浓度升高的激活细胞，但这些步调需要通过植入物向深层组织传递光信号，无法在目田步履的动物中非侵入性地使用。8月5日Nature Methods的盘考报谈“Rapid, biochemical tagging of cellular activity history in vivo”，先容了一种新式酶催化步调，通过在体内快速生化标志Ca2+浓度升高的细胞。该步调期骗Ca2+激活的split-TurboID（CaST）酶，在外源生物素（biotin）分子的援救下，在10分钟内标志激活的细胞。酶促信号跟着Ca2+浓度和生物素标志时辰的加多而增强，标明CaST不错行动总Ca2+步履的时辰门控整合器。此外，与需要数小时才能产生信号的转录证明基因不同，CaST的读出不错在步履标志后立即进行。

细胞内离子浓度的动态变化使细胞粗略反映和适合其局部环境，最终有助于机体的平日生理功能。举例，神经元行动大脑的基本功能单位，不错被多样外部刺激或药理化合物激活，导致细胞内Ca2+浓度的快速波动。因此，通过细胞内Ca2+水平的变化不错径直权衡复杂神经蚁集的步履。遗传编码的Ca2+指令剂一经极地面改变了咱们在清澈和步履的动物中记载神经步履的材干。然则，荧光传感器的一个主要限制是其读出信号是瞬时的，况且常常需要侵入性的步调才能得回深层脑结构的光学信号。这使得将给定神经元的步履历史与其浩荡其他细胞脾性（举例精准的空间定位、RNA抒发或卵白质抒发）相勾通变得具有挑战性。

为克服这一问题，先前的盘考盘算推算了正交转录证明基因（如FLARE、FLiCRE、Cal-Light）或荧光卵白（如CaMPARI）以清醒标志在高细胞内Ca2+水平下激活的细胞。然则，这些步调皆依赖光敏卵白质，需要蓝光或紫外光来限制细胞步履标志的时辰窗口。这一要求限制了其在深层脑区或无法植入光纤的体区的可推广性。另一个清醒标志的步调包括基于即刻早期基因（IEG）的转录证明基因（如TRAP2和tetTag），这些步调期骗药物打针而非光照来适度步履标志窗口。然则，天然IEG步履已被评释与多种细胞类型的神经步履臆想，但它远不如Ca2+行动通用的读出信号。此外，IEG抒发的缓缓起效限制了在特定时辰窗口内立即标志和识别激活的神经元的材干。

在该盘收用，盘考东谈主员盘算推算了一种依赖于Ca2+的酶，通过将外源生物素分子畅达到激活的细胞上，来证明活细胞内Ca2+水平的升高。重新盘算推算并重新期骗了一种近距离标志酶split-TurboID，以在活细胞内通过外源生物素分子标志卵白质来证明细胞内Ca2+水平的升高。这种步调在不需要光照的情况下，粗略在几分钟内标志细胞，为神经步履记载提供了一种快速、非侵入性的新计谋。

细胞内钙离子（Ca2+）行动一种弥留的信号分子，险些参与了整个的细胞信号传导过程。在神经元中，Ca2+浓度的变化与神经步履密切臆想，是盘考神经蚁集步履的弥留成见。当今，期骗荧光传感器和证明基因不错检测Ca2+浓度升高的激活细胞，但这些步调每每需要侵入性操作，举例植入物来向深层组织传递光信号，这使得在目田步履的动物中进行非侵入性检测变得贫寒。

为了克服这些限制，盘考东谈主员盘算推算了一种基于酶催化的生化标志技巧，粗略快速标志Ca2+浓度升高的细胞。这项技巧被称为Ca2+激活的split-TurboID（CaST），通过外源生物素（biotin）分子的援救，在10分钟内完成标志。这种步调不仅快速，而且粗略在不使用光照的情况下收尾细胞标志，从而大大普及了其在深层脑区和其他体内组织中的应用后劲。

盘考团队领先盘算推算了一种依赖Ca2+的酶，这种酶粗略在Ca2+浓度升高时重组并激活，从而标志标的细胞。具体来说，CaST由两部分构成：一部分是与Ca2+勾通的钙调卵白（calmodulin，CaM），另一部分是合成肽M13。这两部分分别畅达到split-TurboID的两个不活跃片断上（sTb(N)和sTb(C)）。当细胞内Ca2+浓度升高时，CaM部分会被招募到M13，从而使split-TurboID重新拼装并激活。在外源生物素存在的情况下，重组后的split-TurboID会标志本身及周围的卵白质。

盘考东谈主员在HEK293T细胞中抒发了不同版块的CaST器具，通过生物素和Ca2+措置细胞，并用Alexa Fluor 647（SA-647）勾通的链霉亲和素（streptavidin）染色来检测生物素标志的卵白质。罢了披露，在外源生物素存鄙人，CaST粗略在Ca2+浓度升高时灵验地标志标的卵白质。

为了考据CaST的灵验性，盘考团队进行了多种现实。他们将CaST的两个片断分别畅达到不同的卵白质上，并通过不同的组合神气抒发在HEK293T细胞中。通过生物素和Ca2+的共同措置，盘考东谈主员发现其中一种组合（膜勾通的CD4-sTb(C)-M13-GFP与胞质中的CaM-V5-sTb(N)）阐发出最高的信号配景比（signal-to-background ratio, SBR）。他们进一步优化了转染比例，发现5:2的转染比例（CD4-sTb(C)-M13-GFP(N)）粗略得回最好的标志恶果。

通过荧皎白微镜和western blot，盘考东谈主员考据了CaST在不同Ca2+浓度和刺激时辰下的标志恶果。罢了披露，CaST的标志信号跟着Ca2+浓度的加多和刺激时辰的延伸而增强，标明其具有邃密的时辰和浓度依赖性。具体现实中，盘考东谈主员在HEK293T细胞中抒发CaST，并通过生物素和Ca2+共同措置细胞。通过荧皎白微镜不雅察到，在生物素和Ca2+共同存在时，细胞内的生物素标志信号显赫增强，而在仅有生物素或Ca2+单独存在时，标志信号较弱或不存在。

CaST的功能和灵验性考据（Credit: Nature Methods）

卵白质结构展望：使用AlphaFold2展望了CaST的两个半部分卵白质结构。图示展示了两部分在单独现象下（预期无Ca2+存在时）和复合现象下（预期高Ca2+存在时）的结构。两部分卵白质在Ca2+依赖下可逆地重新拼装。展望的生物素勾通位点以蓝色披露。

CaST盘算推算：CaST在HEK细胞中的抒发盘算推算透露图。包含sTb(C)-M13-GFP的部分通过CD4细胞膜卵白的跨膜域锚定在膜上，而CaM-V5标签-sTb(N)部分则在胞质中抒发。只消在细胞继承生物素措置并阐发出升高的细胞内Ca2+时，CaST才会标志卵白质。

荧光图像：HEK细胞的共聚焦图像，这些细胞同期转染了CaST的两个部分，并在±Ca2+的条目下措置30分钟生物素。细胞被洗涤、固定，并用抗V5和SA-647染色。抗V5信号标志了CaM-sTb(N)部分，而GFP荧光披露了CD4-sTb(C)-M13部分。卵白质的生物素化通过SA-647染色检测。

Western blot分析：HEK细胞被转染CaST并在±50 µM生物素和±Ca2+（5 mM CaCl2和1 µM ionomycin）条目下措置30分钟。细胞随后用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤，蚁集全细胞裂解液，并使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）或抗V5/HRP进行Western blot分析。‘N’透露预期的CaM-V5-sTb(N)片断大小，而‘C’透露预期的CD4-sTb(C)-M13-GFP片断大小。

生物素化卵白质的定量：量化了Western blot现实中的生物素化卵白质。两次寂寞的生物重叠进行了量化，通盘条带下方的75-kDa内源性生物素化条带被纳入量化（总原始强度像素值的总额）。

为了测试CaST的清醒性，盘考东谈主员将HEK细胞措置30分钟的Ca2+后洗涤10分钟，再加入生物素进行30分钟的标志。罢了披露，洗涤后的细胞莫得出现显赫的标志信号，标明CaST的重组和激活是可逆的。此外，通过加多Ca2+浓度进行滴定现实，罢了披露CaST的标志信号与Ca2+浓度呈线性臆想，进一步考据了其高奢睿度和特异性。

盘考标明，CaST粗略在体外和体内高效地标志Ca2+浓度升高的细胞。在HEK细胞现实中，CaST在生物素和Ca2+共同存在时阐发出显赫的标志信号，而在仅有生物素或Ca2+单独存在时，标志信号较弱或不存在。这标明CaST粗略行动一种Ca2+依赖的标志器具，灵验分散不同条目下的细胞步履。

在进一步的现实中，盘考东谈主员通过荧皎白微镜和西方思路法考据了CaST在不同Ca2+浓度和刺激时辰下的标志恶果。罢了披露，CaST的标志信号跟着Ca2+浓度的加多和刺激时辰的延伸而增强，标明其具有邃密的时辰和浓度依赖性。

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CaST的性能（Credit: Nature Methods）

HEK细胞的荧皎白微镜图像：图像展示了转染CaST的HEK细胞在50 µM生物素和±Ca2+（5 mM CaCl2和1 µM ionomycin）条目下措置30分钟的情况。顶部披露SA-647染色的生物素化卵白质，底部披露CD4-sTb(C)-M13-GFP。

单细胞分析：单细胞分析罢了披露了不同GFP抒发水平下细胞的SA-647标志与GFP荧光强度的散点图。罢了标明，在加生物素和Ca2+条目下，SA-647染色显赫加多，而仅有生物素时则莫得显赫加多。

SA-647/GFP荧光比率的散布：小提琴图展示了不同措置条目下单细胞SA-647/GFP荧光比率的散布。加生物素和Ca2+的条目下，SA-647/GFP比率显赫高于其他条目。

CaST-IRES构诞生涯透露图：展示了双顺反子CaST-IRES构建的盘算推算，用于在HEK细胞中同期抒发CaST的两个部分。

CaST-IRES的荧光图像：展示了转染CaST-IRES的HEK细胞在50 µM生物素和±Ca2+条目下措置30分钟的情况。与之前肖似，顶部披露SA-647染色的生物素化卵白质，底部披露CD4-sTb(C)-M13-GFP。

单细胞分析（CaST-IRES）：散点图披露了不同措置条目下，GFP阳性细胞的平均SA-647与平均GFP荧光强度的关系。罢了标明，在加生物素和Ca2+条目下，SA-647染色显赫加多，而仅有生物素时则莫得显赫加多。

SA-647/GFP荧光比率的散布（CaST-IRES）：小提琴图展示了不同措置条目下单细胞SA-647/GFP荧光比率的散布。加生物素和Ca2+的条目下，SA-647/GFP比率显赫高于其他条目。

CaST非IRES与IRES版块的比较：图表展示了CaST非IRES和IRES版块在不同条目下的SA-647/GFP荧光比率的散布。IRES版块的CaST在加生物素和Ca2+条目下的标志恶果显赫优于非IRES版块。

ROC弧线分析：ROC弧线分析披露了CaST非IRES和IRES版块分散Ca2+措置和非措置细胞群体的材干。非IRES版块的AUC为0.87，而IRES版块的AUC为0.93，标明IRES版块在分散活化与未活化细胞方面具有更高的精准度。

神经元现实

盘考东谈主员将CaST应用于培养的神经元中，考据其在神经细胞中的灵验性。他们使用腺臆想病毒（AAV）在大鼠海马神经元中抒发CaST，并通过钾离子（KCl）刺激神经元，不雅察Ca2+浓度变化和CaST标志情况。罢了披露，CaST粗略在KCl刺激后的10分钟内灵验标志Ca2+浓度升高的神经元。此外，盘考东谈主员还期骗CaST检测了不同药理学试剂对神经元Ca2+浓度的影响。举例，多巴胺（dopamine，DA）和2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（DOI）对神经元Ca2+浓度的更正恶果。罢了标明，DOI粗略显赫普及神经元内Ca2+浓度并引起CaST标志，而DA则未能显赫影响Ca2+浓度。

CaST在培养的神经元中的性能（Credit: Nature Methods）

神经元中CaST的抒发和标志：a部分展示了培养的大鼠海马神经元中抒发CaST的荧皎白微镜图像。这些神经元被腺臆想病毒（AAV）感染，抒发CD4-sTb(C)-M13-GFP和CaM-sTb(N)两个部分，并在±生物素和±KCl条目下措置30分钟。图像披露了生物素化卵白质的SA-647染色，GFP荧光标志了CD4-sTb(C)-M13。

不同措置条目下的SA-647/GFP比率：b部重量化了图a中不同措置条目下的SA-647/GFP荧光比率。罢了披露，+生物素 +KCl条目下的比率显赫高于其他条目。

10分钟KCl刺激后的CaST标志：c部分展示了神经元在10分钟±生物素和±KCl条目下措置后的荧皎白微镜图像。罢了披露，在生物素和KCl共同措置下，SA-647标志显赫增强。

10分钟标志的SA-647/GFP比率：d部重量化了图c中不同措置条目下的SA-647/GFP荧光比率。罢了标明，在10分钟的KCl和生物素共同措置下，SA-647/GFP比率显赫加多。

GFP+神经元中的SA-647标志比例：e部重量化了10分钟和30分钟标志现实中，GFP+神经元中SA-647+细胞的比例。罢了披露，在生物素和KCl共同措置下，10分钟标志的SA-647+细胞约占GFP+神经元的35%，而30分钟标志的则约占65%。而在仅有生物素措置下，SA-647+细胞比例较低（约10%）。

不同药物措置后的CaST标志：f部分展示了大鼠海马神经元在50 µM生物素和10 µM DA、10 µM DOI或30 mM KCl条目下措置30分钟后的荧皎白微镜图像。罢了标明，DOI和KCl措置显赫加多了SA-647标志，而DA措置未显赫影响SA-647标志。

不同药物措置条目下的SA-647/GFP比率：g部重量化了图f中不同药物措置条目下的SA-647/GFP荧光比率。罢了披露，KCl和DOI措置显赫加多了SA-647/GFP比率，而DA措置未显赫影响该比率。

动物现实

盘考东谈主员进一步在小鼠模子中考据了CaST的应用。他们在小鼠前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）中抒发CaST，并通过迷幻药物（如psilocybin）教导神经元步履。通过测量小鼠的头部舞动反应（head-twitch response，HTR），盘考东谈主员发现，psilocybin粗略显赫加多PFC神经元的Ca2+浓度，并引起CaST标志。这一罢了标明，CaST粗略在目田步履的小鼠中，非侵入性地标志和检测神经步履。

CaST在小鼠体内非侵入性标志和检测psilocybin激活的神经元的材干（Credit: Nature Methods）

现实透露图：a部分展示了使用CaST标志psilocybin激活的神经元的现实经过。小鼠打针CaST病毒后，在目田步履现象下进行psilocybin措置，并通过生物素标志激活的神经元。随后进行SA-647染色和头部舞动反应（HTR）的测量。

mPFC区域的SA-647和GFP荧光图像：b部分展示了前额叶皮层（mPFC）区域的荧皎白微镜图像，对比了打针生物素+生理盐水和生物素+psilocybin的小鼠。罢了披露，psilocybin措置的小鼠mPFC区域的SA-647标志显赫加多。

单个神经元的SA-647与GFP荧光强度：c部重量化了b部分中每个GFP+神经元的SA-647与GFP荧光强度。水平虚线透露生物素+生理盐水组中整个SA-647神经元的第90百分位阈值。

FOV的SA-647/GFP比率：d部重量化了c部分中不同视线（FOV）的SA-647/GFP荧光比率。罢了披露，psilocybin措置的小鼠比率显赫高于生理盐水措置的小鼠。

SA-647+神经元的比例：e部分展示了整个GFP+神经元中SA-647+神经元的比例。罢了标明，psilocybin措置组中粗陋70%的GFP+神经元阐发出强SA-647标志，而生理盐水措置组中这一比例较低。

SA-647+神经元与HTR的臆想性：f部分展示了SA-647+ mPFC神经元在HTR测量时间的细胞掩膜。具有疏通数目HTR的视线来自疏通的小鼠，但来自对侧半球的寂寞CaST打针。

HTR数目与SA-647+神经元数目的关系：g部重量化了f部分数据中每平方毫米SA-647+神经元数目与HTR数目的关系。罢了标明，SA-647+神经元数目与HTR数目呈正臆想。

HTR数目与SA-647/GFP比率的关系：h部重量化了f部分数据中整个神经元的平均SA-647/GFP比率与HTR数目的关系。罢了披露，psilocybin措置组中具有HTR的小鼠的SA-647/GFP比率显赫加多。

与c-Fos的对比：i部分展示了psilocybin措置后mPFC区域的CaST GFP、SA-647和c-Fos染色图像。罢了披露，psilocybin措置显赫加多了SA-647标志，但对c-Fos标志影响较小。

c-Fos+神经元数目：j部重量化了每平方毫米c-Fos+神经元数目。罢了披露，psilocybin措置未显赫加多mPFC区域的c-Fos标志。

SA-647+神经元数目：k部重量化了每平方毫米SA-647+神经元数目。罢了披露，psilocybin措置显赫加多了mPFC区域的SA-647标志。

SA-647+/GFP+神经元比例：l部分展示了每平方毫米FOV中SA-647+神经元占GFP+神经元的比例。罢了标明，psilocybin措置显赫加多了该比例。

CaST技巧的出现为细胞步履的非侵入性标志提供了一种新的器具。比较于传统的荧光传感器和转录证明基因，CaST具有标志速率快、非侵入性和高效的特色。这使得它在深层脑区和其他难以光学走访的体内组织中具有世俗的应用出路。

改日，CaST有望被用于盘考神经蚁集步履与行径之间的关系。举例，在盘考迷幻药物对神经步履的影响时，CaST不错用来标志和分析药物作用下的神经元步履。此外，CaST还不错与其他空间分子成像技巧勾通，揭示特定时辰窗内激活的神经元的基因抒发和卵白质散布情况，从而为神经科学盘考提供更全面的视角。

总之，CaST行动一种快速、非侵入性和高效的细胞步履标志器具，具有宏大的应用出路和弥留的盘考价值。通过进一步优化和推广其应用边界，CaST有望在神经科学和其他生物医学限度产生深入的影响。

参考文件

Zhang R, Anguiano M, Aarrestad IK, Lin S, Chandra J, Vadde SS, Olson DE, Kim CK. Rapid, biochemical tagging of cellular activity history in vivo. Nat Methods. 2024 Aug 5. doi: 10.1038/s41592-024-02375-7. Epub ahead of print. PMID: 39103446.

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02375-7

责编|探索君

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